發布日期：2022-04-26 點擊率：101
PCR擴增產物的克隆可以：（1）獲得目的DNA片段；（2）用于原核表達的研究；（3）廣泛應用于分子生物學相關研究。
平端連接法
實驗方法原理 | 平頭連接是將制備好的平頭載體和補平或削平的PCR產物直接進行連接。載體可用EcoR V或Sma I切成平頭；PCR產物純化后，可以在22℃用DNA聚合酶I作用30min（利用該酶所具有的3’→5’外切酶活性和5’→3’的聚合酶活性）。 |
實驗材料 | 模板DNA |
試劑、試劑盒 | SauIKlenow片段T4連接酶 |
儀器、耗材 | 移液器、移液器吸頭、PCR小管、DNA擴增儀、電泳槽、電泳儀、臺式高速離心機 |
實驗步驟 | 一、PCR反應
1. 依次混勻下列試劑
（1）H2O：35 μl
（2）10×PCR反應緩沖液：5 μl
（3）25 mmol/L MgCl2：4 μl
（4） 4種dNTP：4 μl
（5）上游引物（引物1）：0.5 μl （6）下游引物（引物2）：0.5 μl
（7）模板DNA（約1 ng）：0.5 μl
（8）混勻后離心5秒。
2. 將混合物在94℃下加熱5分鐘后冰冷，迅速離心數秒， 使管壁上液滴沉至管底，加入Taq DNA聚合酶（0.5 μl約2.5 U），混勻后稍離心，加入一滴礦物油覆蓋于反應混合物上。
3. 用94℃變性1分鐘，45℃退火1分鐘， 72℃延伸2分鐘， 循環35輪，進行PCR。最后一輪循環結束后， 于72℃下保溫10分鐘，使反應產物擴增充分。
二、電泳
取10 μl擴增產物用1％瓊脂糖凝膠進行電泳分析，檢查反應產物及長度。
三、PCR產物的純化
擴增的PCR產物如利用T-Vector進行克隆，可直接使用，如用平未端或粘性未端連接，往往需要將產物純化。
1. 酚/氯fang法
（1）取反應產物加100 μl TE。
（2）加等體積氯fang混勻后用微型離心機10000 rpm離心15秒，用移液器將上層水相吸至新的小管中。這樣抽提一次， 可除去覆蓋在表面的礦物油。
（3）再用酚:氯fang:異戊醇抽提二次，每次回收上層水相。
（4）在水相中加300 μl 95％乙醇，置-20℃下30 min沉淀。
（5）在小離心機上10000 rpm離心10 min，吸凈上清液。加入1 ml 70％乙醇，稍離后，吸凈上清液.重復洗滌沉淀2次。將沉淀溶于7 ml ddH2O 中，待用。
2. Wizard PCR DNA純化系統
Wizard PCR DNA純化系統可以快速、有效、可靠地提取PCR擴增液中的DNA，提純后的DNA可用于測序、標記、克隆等。 該系統中含有的試劑和柱子可供50次PCR產物的純化，試劑包括：50 ml Wizard PCR DNA純化樹脂、5 ml 直接提取緩沖液、50支 Wizard微型柱。
（1）吸取PCR反應液水相放于1.5 ml eppendorf管中。
（2）加100 ml直接提取緩沖液，渦旋混勻。
（3）加1 ml PCR DNA純化樹脂，1分鐘內渦旋混合3次。
（4）取一次性注射器， 取出注塞，并使注射筒與Wizard微型柱連接，用移液槍將上述混合液加入注射筒中，并用注塞輕推，使混合物進入微型柱。
（5）將注射器與微型柱分開，取出注塞， 再將注射筒與微型柱相連，加入2 ml 80%異丙醇，對微型柱進行清洗。
（6）取出微型柱置于eppendorf管中，12 000 g離心20秒，以除去微型柱中的洗液。
（7）將微型柱放在一個新eppendorf管中，加50 μl TE或水，靜止1分鐘后，12 000 g離心20秒。
（8）丟棄微型柱，eppendorf管中的溶液即為純化DNA，存放于4℃或-20℃。
四、載體加dT尾 |
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